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DNA甲基化是一种遑急的表不雅遗传机制，对转座子千里默和基因组圆善性至关遑急。在进化经过中，DNA甲基化底物在不同生物界中发生各类化。在植物中，染色体甲基化酶3（CMT3）和CMT2折柳介导CHG和CHH位点的甲基化。筹谋词，这两种甲基振荡酶在进化经过中怎么分化其底物特异性仍然未知。

近日，河南大学蒋建军耕种为第一作家，好意思国圣路易斯华盛顿大学钟雪花耕种和加州大学河畔分校宋吉奎耕种为共同通信在Science子刊《Science Advances》上发表了题为“Substrate specificity and protein stability drive the divergence of plant-specific DNA methyltransferases”的研究论文，揭示了底物特异性和卵白质踏实性怎么运转植物特异性DNA甲基振荡酶分化，十分是CMT2和CMT3在进化经过中的底物特异性分化，确认了CMT2和CMT3产生功能分化的表不雅遗传调控机制。

标题：Substrate specificity and protein stability drive the divergence of plant-specific DNA methyltransferases（底物特异性和卵白质踏实性促进植物特异性DNA甲基振荡酶分化）

发表时间：2024年11月6日

发表期刊：Science Advances

影响因子：IF 11.7 / 1区

应用本领：BS-seq、RNA-seq（易基因金牌本领）

本研究进行了全面的结构、功能和进化研究，分析了CMT2和CMT3分化背后的分子机制。研究领先揭示了对CMT3识别CHG至关遑急的精氨酸残基（R745）在CMT2中推崇出很大的变异，解说了其失去CHG特异性的原因。在拟南芥中，将CMT2中相应的残基突变为精氨酸（V1200R）取得了CHG甲基化活性，并在cmt2cmt3突变体中从头千里默一组转座元件（TEs），领悟了类似CMT3功能。CMT3有一个短的N终端，CMT2却包含一个长而无序的N终端，这是很多植物物种的共同特征。这个长的N终端调控CMT2踏实性，并介导热率领的CMT2降解。此外由于当然界中CMT2的N端存在多种变异，CMT2的N端更具可塑性，大约高度容忍各式当然变异。总的来说，本研究揭示了植物种染色体甲基化酶靶向特定环境DNA甲基化的分化机制，并为植物中DNA甲基化的功能和进化提供了新的视角。

研究容貌：

结构和功能研究：通过比较CMT3和CMT2的关节残基，构建了CMT2与DNA复合物的结构模子，并进行体外甲基化施行。系统发育分析：通过系统发育分析讨论CMT2和CMT3的进化筹谋。基因剪辑：通过在拟南芥中引入V1200R突变，研究者们增强了CMT2的CHG甲基化活性。DNA甲基化分析：愚弄全基因组亚硫酸盐测序（WGBS-seq）本领分析CMT2和CMT2V1200R对全基因组甲基化水平的影响。转录组测序：通过RNA-seq分析CMT2V1200R介导CHG甲基化对基因抒发的影响。当然变异分析：分析当然条目下的CMT2变异，以及这些变异对DNA甲基化和植物相宜性影响。

成果图形

（1）CMT2发源于吐花植物中CMT3的复制，CMT2V1200R在体外和体内率领CHG甲基化增多

图1：精氨酸残基丢失使CMT2具有与CMT3不同的底物偏好。

A. 绿色植物（Viridiplantae）中CMT3（或其近缘同源物hCMTα/β）和CMT2的系统发育树。

B. CMT2和CMT3之间的卵白质序列袪除性（左图）以及在吐花植物中与+2鸟嘌呤（G+2）战斗的残基和CMT2中的相应残基（右图）。

C. 在cmt3突变配景下，M. polymorpha CMT3（MpCMT3）和C. braunii CMT3（CbCMT3）的CHG甲基化水平Meta图。

D. 拟南芥中通盘转座元件（TEs）上的平均CHG甲基化水平Meta图。

E. CHG低甲基化区域（hypoDMRs）上的CHG甲基化水平箱线图。

F. CMT2和CMT2V1200R对CHH、CHG或半甲基化CHG（hmCHG）DNA底物的体外DNA甲基振荡酶检测。

G. 玉米ZMET2-DNA复合物结构（卵白质数据库7UBU）裸露ZMET2 Y526和R804与CHG环境中目的胞嘧啶+2位点（G+2）鸟嘌呤之间的互相作用。

H. 两个寥寂的转基因CMT2和CMT2V1200R植物在cmt2cmt3（cc）突变配景下的表型图像。

I. 免疫陈迹图裸露（H）中植物的CMT2和CMT2V1200R卵白水平。

J. McrBC-qPCR分析两个CMT2靶向TEs Copia89和Copia18A的DNA甲基化水平。

K. BS-seq中Copia89的CHG和CHH甲基化水平的基因组浏览器视图。

L. 拟南芥中通盘TEs上的平均CHG甲基化水平Meta图。

M. 与Col-0比较时轻视DMRs的访佛情况维恩图。

（2）CMT2V1200R介导的CHG甲基化遏止TE

图2. CMT2V1200R遏止CMT2和CMT3靶向的转座元件（TEs）。

A. 两个寥寂的CMT2/cc和V1200R/cc转基因系中上调TEs的抒发水平热图。cc代表cmt2cmt3。虚线框示意被CMT2V1200R从头千里默的TEs。

B. CMT2/cc中仍然抒发的TEs的CHG和CHH DNA甲基化水平。

C. 在CMT2/cc和V1200R/cc转基因植物中，通过RT-qPCR检测Copia11和Copia47的相对转录水平。

D. CMT2/cc和V1200R/cc中相反抒发基因（DEGs）数目。

E. V1200R/cc中上调基因的基因内容（GO）分析。

（3）CMT2包含一个对审定位很遑急的长N终端

图3. CMT2的长N端无序，且调控卵白水平。

A. 拟南芥（A. thaliana，双子叶植物）和A.trichopoda（基部被子植物）的CMT2和CMT3域结构图表。蓝色条示意串联重复。MT，甲基振荡酶域；CD，染色质域。线上的数字示意域之间的氨基酸数目。WGD，全基因组复制。

B. A.trichopoda和A. thaliana CMT2 N端保守RRS motif比对。

C. A.trichopoda和A. thaliana CMT2的固有无序得分图，由PONDR评分。

D. 在A. thaliana cmt2突变配景下抒发全长A.trichopoda CMT2（AmtriCMT2）和N端截短的A.trichopoda CMT2（AmtriCMT2ΔN）的卵白水平免疫陈迹。

E. RT-qPCR裸露AmtriCMT2和AmtriCMT2ΔN转基因系中AmtriCMT2转录水平。

F. 野生型（CMT3）和N端疏导的CMT3（CMT2N-CMT3ΔN）转基因系在cmt3突变体中的卵白水平免疫陈迹。

G. RT-qPCR裸露CMT3和CMT2N-CMT3ΔN转基因植物中CMT3转录水平。

H. 野生型（CMT2）和N端疏导的CMT2（CMT3N-CMT2ΔN）转基因系在A. thaliana cmt2突变体中的卵白水平免疫陈迹。

I. RT-qPCR裸露CMT2和CMT3N-CMT2ΔN转基因系中CMT2转录水平。

转录水平领先归一化到Col-0中的CMT2水平，然后归一化到Col-0中的ACT7水平。ns，无权贵性相反。

（4）CMT2的N终端调控卵白质踏实性

图4. CMT2的N终端调控其卵白踏实性。

A. 用500 μM环己酰亚胺（CHX）赓续指定时间后CMT3（顶部）和CMT2N-CMT3ΔN（底部）的水平免疫陈迹图。使用7日龄幼苗。肌动卵白动作对照。R1和R2代表两个生物学重复。

B. 相对于肌动卵白归一化的卵白水庄重量。

C. 免疫陈迹图裸露用500 μM环己酰亚胺赓续指定时间后CMT2（顶部）和CMT3N-CMT2ΔN（底部）的水平。

D. 免疫陈迹图裸露用500 μM环己酰亚胺赓续后CMT2N-GFP（顶部）和仅GFP（底部）的水平。右侧是通过GFP信号相对于肌动卵白表率化的卵白水庄重量。

（5）N终端介导热率领的CMT2降解

图5. 长N终端介导热率领的CMT2卵白降解。

A. 免疫陈迹图裸露在37°C热赓续指定时间后CMT3（顶部）和CMT2N-CMT3ΔN（底部）的水平。使用10日龄幼苗。

B. 相对于肌动卵白归一化的卵白水庄重量。

C. 免疫陈迹图裸露在37°C热赓续指定时间后CMT2（顶部）和CMT3N-CMT2ΔN（底部）的水平。

D. 免疫陈迹图裸露在37°C热赓续后CMT2N-GFP（顶部）和仅GFP（底部）的水平。

E. 共聚焦显微镜图像裸露在37°C热赓续指定时间后，拟南芥根尖中CMT2N-GFP和CMT2-GFP的定位和强度。

（6）CMT2当然变异推崇出对环境威迫的耐受性

图6. 拟南芥中CMT2的当然变异。

A. 拟南芥近缘种CMT2基因的dN/dS绘制。

B. 不同CMT2基因突变的品系全基因组CHH甲基化水平。

C. 野生型（WT；n=25）、N端（第1外显子(n=31)和第3外显子(n=16)的AT4G19020.1）和C端（n=2）CMT2突变的CHH甲基化点图。

D. 拟南芥生态型Col-0和Lhasa-0的表型比较。

E. 来自青藏高原的当然品系Lhasa-0和Tibet-0的基因组浏览器视图，裸露CMT2外显子中的单核苷酸变异（SNV）和插入。

F. 与野生型Col-0和CHH DNA甲基振荡酶突变体比较，Lhasa-0生态型在拟南芥染色体上的平均水平CHH甲基化。

G. Lhasa-0与CHH DNA甲基振荡酶突变体之间低甲基化相反甲基化区域（DMRs）的访佛。

H. McrBC-qPCR分析裸露在两个代表性位点的DNA甲基化互补。含有CMT2基因组序列（gCMT2）的转基因系可以营救Lhasa-0中丢失的CHH甲基化。Tibet-0用作对照。AMD，竣工甲基化相反。

易小结

本研究通过WGBS+RNA-seq中分析揭示了植物中CMTs的分化机制，为贯通DNA甲基化在植物进化和功能中的作用提供了遑急观念。

研究亮点

1) CMT2的发源和进化：研究揭示了CMT2是怎么从CMT3分化而来，以及这一分化怎么影响了植物的DNA甲基化方法。

2) V1200R突变的功能研究：通过V1200R突变，研究者们得手地改变了CMT2的底物特异性，这一发现对于贯通酶活性的调控具有遑急真谛。

3) CMT2 N端的踏实性研究：研究者们发现CMT2的长N终端在热应激下对其踏实性至关遑急，这一发现为贯通环境要素怎么影响表不雅遗传机制提供了新的视角。

4) 当然变异与环境相宜性：通过分析当然条目下CMT2的变异，研究者们揭示了这些变异怎么影响植物对环境应激的相宜性，这对于贯通植物进化和育种具有遑急真谛。

这项研究不仅增进了对植物DNA甲基化机制的贯通，还为农业育种和作物篡改提供了潜在的分子靶标。

对于易基因全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）

全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精准的检测通盘单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金表率。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供遑急本领撑捏，能正常应用在个体发育、朽迈和疾病等人命经过的机制研究中，亦然各物种甲基化图谱研究的首选容貌。

易基因全基因组甲基化测序本领通过T4-DNA贯穿酶，在超声波打断基因组DNA片断的两头贯穿臆测序列，贯穿居品通过重亚硫酸盐赓续将未甲基化修饰的胞嘧啶C调动为尿嘧啶U，进而通过臆测序列介导的 PCR 本领将尿嘧啶U调动为胸腺嘧啶T。

应用目的：

WGBS正常用于各式物种，要求全基因组扫描（可以过关节位点）

全基因组甲基化图谱课题象征物筛选课题小界限研究课题

本领上风：

应用范围广：适用于通盘参考基因组已知物种的甲基化研究；全基因组遮盖：最大铁心地获取圆善的全基因组甲基化信息，精准绘制甲基化图谱；单碱基分辨率：可精准分析每一个C碱基的甲基化景象。

易基因提供全面的表不雅基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化）和表不雅转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C）、染色质结构与功能组学本领决议（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900。

参考文件：

Jiang J, Gwee J, Fang J, Leichter SMkaiyun体育, Sanders D, Ji X, Song J, Zhong X. Substrate specificity and protein stability drive the divergence of plant-specific DNA methyltransferases. Sci Adv. 2024 Nov 8;10(45):eadr2222. doi: 10.1126/sciadv.adr2222. PubMed PMID: 39504374.

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